Préparation des bactéries

Préparation de bactéries compétentes

Préambule : vous pouvez éviter de mettre en oeuvre ce protocole en commandant directement à un laboratoire des bactéries compétentes. Toutefois, il est toujours judicieux de connaître l'un des procédés permettant de perméabiliser la paroi bactérienne ( = bactéries compétentes).

Protocole - pour 50 mL de culture

1 - Ensemencer le milieu liquide Luria Broth (LB) au 1/100 avec culture de la nuit. Incuber à 37°C avec agitation.

2 - Quand DO₅₅₀ = 0,45 bloquer la croissance dans la glace pendant 15 minutes. Transférer dans des récipients de centrifugation refroidis.

3 - Centrifuger 15 minutes à 2500 rotations par minute (rpm) à 4°C.

4 - Jeter le surnageant en égouttant au maximum et reprendre le culot dans un petit volume de CaCl₂ 100mM glacé avec agitation douce. Compléter à 20 mL avec la même solution.

5 - Conserver 15 minutes dans la glace (ou plus).

6 - Centrifuger 15 minutes à 2500 rpm à 4°C.

7 - Jeter le surnageant, essuyer les parois et reprendre le culot dans un petit volume de CaCl₂ 100mM -15% glycérol glacé avec agitation douce. Compléter à 1,25 mL.

8 - Laisser dans la glace 15 minutes au moins.

9 - Aliquoter, refroidir dans l'azote liquide. Conserver à -70°C.

Transgenèse	Description	Ressources	Protocoles	Biblio	Sites
Mise à jour : 14/08/2001 Glossaire Histoire Téléchargements Précautions Préparation de bactéries Transformation bactérienne Préparation d'ADN plasmidique Digestion de l'ADN Transfert d'ADN sur membrane Hybridation Révélation de l'hybridation Marquage de l'ADN et purification	Préparation de bactéries compétentes Préambule : vous pouvez éviter de mettre en oeuvre ce protocole en commandant directement à un laboratoire des bactéries compétentes. Toutefois, il est toujours judicieux de connaître l'un des procédés permettant de perméabiliser la paroi bactérienne ( = bactéries compétentes). Protocole - pour 50 mL de culture 1 - Ensemencer le milieu liquide Luria Broth (LB) au 1/100 avec culture de la nuit. Incuber à 37°C avec agitation. 2 - Quand DO₅₅₀ = 0,45 bloquer la croissance dans la glace pendant 15 minutes. Transférer dans des récipients de centrifugation refroidis. 3 - Centrifuger 15 minutes à 2500 rotations par minute (rpm) à 4°C. 4 - Jeter le surnageant en égouttant au maximum et reprendre le culot dans un petit volume de CaCl₂ 100mM glacé avec agitation douce. Compléter à 20 mL avec la même solution. 5 - Conserver 15 minutes dans la glace (ou plus). 6 - Centrifuger 15 minutes à 2500 rpm à 4°C. 7 - Jeter le surnageant, essuyer les parois et reprendre le culot dans un petit volume de CaCl₂ 100mM -15% glycérol glacé avec agitation douce. Compléter à 1,25 mL. 8 - Laisser dans la glace 15 minutes au moins. 9 - Aliquoter, refroidir dans l'azote liquide. Conserver à -70°C.