Principe : séparer des macromolécules selon leur poids moléculaire et/ou leur forme dans une solution de centrifugation sous l'effet d'un champ gravitationnel intense ( lors de rotations dans une centrifugeuse). En effet la distance de migration en un temps donné est fonction du PM et de la forme de la macromolécule.

La solution de centrifugation est souvent un gradient de concentration de saccharose. Il permet de stabiliser la séparation des molécules au cours puis à la fin de l'ultracentrifugation. Ici, la mesure de la vitesse de migration d'une particule donnée permet de déterminer sa constante de sédimentation (S) qui est liée à la forme et au PM de la particule étudiée.
Ce type de centrifugation est utilisée pour séparer grossièrement des fragments dont les tailles se répartissent sur qq kb. 

Utilisations majeures :

• purification des bras (court et long) des phages. 
• sélection des fragments d'ADN de tailles correctes compte tenu du vecteur utilisé lors de la constitution des banques génomiques.
• isolement des polysomes
• fractionner des ARN (séparer des ARN 28S, 18S,5S,ARNt et ARNm)

Deux techniques sont largement utilisées dans les laboratoires pour séparer les molécules selon leur densité : la centrifugation en gradient continu et la centrifugation en gradient discontinu
 

• Centrifugation isopycnique (gradient continu) 


Une solution de chlorure de césium (CsCl) de densité donnée soumise à une force de gravité intense forme spontanément un gradient de densité continu.La résolution de tels gradients atteint le centième d'unité de densité. Les molécules ajoutées à la solution de ClCs vont se placer, au cours de la migration, dans la zone du gradient dont la densité est la même que la leur. Ce type d'ultracentrifugation est très résolutif mais d'un maniement délicat.

Utilisations majeures :

- préparation de plasmides et de phages. Ainsi pour purifier, par exemple,la forme super-enroulée d'un plasmide bactérien.Cette molécule devant être séparée des protéines, de l'ARN bactérien, de l'ADN chromosomique linéaire et de l'ADN plasmidique relaché. Ces macromolécules ont des densités très voisines comprises entre 1,25 et 1,3 g/ml. La présence de ClCs va provoquer la fixation différentielle d'ions Cs+ sur ces macromolécules. Leur densité apparente est alors modifiée : protéine = 1,3g/ml ARN = 1,75-1,89g/ml ADN = 1,6-1,79g/ml. Ces macromolécules sont alors aisément séparées lors de la centrifugation.

L'emploi de bromure d'éthidium permet d'augmenter la différence de densité entre l'ADN super-enroulé et l'ADN relaché/linéaire et d'obtenir une séparation optimale.

- séparation de deux molécules identiques dont l'une est marquée par un isotope lourd.

• Centrifugation sur coussin (gradient discontinu) 


Le gradient est préformé par des dépôts successifs (appelés coussins) de solution de ClCs de densité croissante. Les différentes molécules et les particules virales ou phagiques vont se placer au cours de la centrifugation au dessus de la couche de ClCs qu'elles ne pourront pas traverser. En effet seules les molécules dont la densité est supérieure à celle du coussin de chlorure de césium pourront le traverser. La fraction est récupérée à l'interface de deux coussins.

Ce type de centrifugation permet de séparer rapidement et facilement des mélanges d'acides nucléiques dont les densités sont différentes, homogènes et connues.

Utilisation majeure : préparation rapide et à grande échelle des phages ou des virus de densité connue.